主要用途

細(xì)胞PDK1激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到PDK1磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中PDK1活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或充分純化酶樣品中PDK1激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

用戶自備 

PDK1激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

比色皿或酶標(biāo)板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對(duì)照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

1． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

2． 加入xx微升底物液（Reagent F）

3． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

4． 加入xx微升陰性液（Reagent G）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

6． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

四、樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升待測樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)板測定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘

8． 光譜測定后，比色皿須清洗充分

9． 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 可以使用PDK1抑制劑（BX 912）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

13． 磷脂酰肌醇依賴性激酶1活性單位濃度定義：

14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品